淺談質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型

一、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件

   現(xiàn)行通用的基因克隆載體，絕大多數(shù)就是以質(zhì)粒為基礎(chǔ)改建而成的。一般說來，一種理想的用作克隆載體的質(zhì)粒必須滿足如下幾個方面的條件：
（1）具有復(fù)制起點

（2）具有抗菌素抗生基因

（3）具若干限制酶單一識別位點

（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 

二、質(zhì)粒載體的選擇記號

　　在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇記號，包括有新陳代謝特性、對大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。但絕大多靈敏的質(zhì)粒載體都是使用抗菌素抗性記號?；蚩寺嶒炛谐Ｓ玫膸追N抗菌素的作用方式及其抗性機理列于。

三、不同類型的質(zhì)粒載體

?。?）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體
　　適于分離大量的高純度的克隆基因的DNA段。如ColE1、pMB1或它們的派生質(zhì)粒。它們不僅具有低分子量、高拷貝數(shù)的優(yōu)點，而且在沒有蛋白質(zhì)合成的條件下仍能繼續(xù)復(fù)制。因此，若在處于對數(shù)生長晚期的含有ColE1一類質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)物中，加入適量的蛋白質(zhì)合成抑制劑講如氯霉素或壯觀霉素處理之后，每個細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)則可擴(kuò)增到1000～3000個之多。如果加入高濃度的尿核苷，質(zhì)粒DNA又可進(jìn)一步擴(kuò)增2～3倍。


　（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體
　　適合于克隆含量過高對寄主代謝有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。這類質(zhì)粒載體的一個普遍性問題是，由于它們體積小、拷貝數(shù)低，與此相應(yīng)的基因劑量也就較少，因此要制備大量的克隆DNA就很困難。


?。?）失控的質(zhì)粒載體
　　失控的質(zhì)粒載體（runaway plasmid vectors）：是一些低拷貝的質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型的，也就是說在不同的溫度下，拷貝數(shù)會有顯著的變化。
　　B.E.Uhlin等人（1979）首先發(fā)展了失控的質(zhì)粒載體pBEU1和Pbeu2。這種質(zhì)粒載體在30℃下，每個寄主細(xì)胞中只含有適量的拷貝數(shù)，而當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35℃時，質(zhì)粒的復(fù)制便失去了控制，每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2～3小時。這期間編碼在質(zhì)粒載體上的基因產(chǎn)物便超過了常量。zui后，細(xì)胞生長受到了抑制，并失去了存活的能力，但在這個階段質(zhì)粒DNA可累積到占細(xì)胞總DNA的50%。


　（4）插入失活型的質(zhì)粒載體
　　選用插入失活型質(zhì)粒，將外源DNA段插入在會導(dǎo)致選擇記號基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽性克隆的幾率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位點，因此都屬于插入失活型的質(zhì)粒載體。


?。?）正選擇的質(zhì)粒載體
　　正選擇質(zhì)粒載體（direct selection vectors）：這種質(zhì)粒載體具有具有直接選擇記號并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。通過選擇具這種表型特征的轉(zhuǎn)化子，便可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕了實驗的工作量，提高了選擇的敏感性。


　（6）表達(dá)型的質(zhì)粒載體
　　使克隆在大腸桿菌中特定位點的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)譯信號控制之下，并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為表達(dá)載體（expression vectors）。它分為表達(dá)型質(zhì)粒載體和表達(dá)型噬菌體載體兩種不同的類型。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　      一種典型的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒載體的主要組成部分，包括大腸桿菌的啟動子及操縱全點序列、多克隆位點、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點及抗菌素抗性基因

     那些沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒被成為天然質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見的要用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColE1RSF2124和pSC101等。
　　鑒于天然質(zhì)粒用作基因克隆載體存在著不同程度的局限性，所以科學(xué)工作者便在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了修飾改造，首先發(fā)展出了一批低分子量、高拷貝、多選擇記號的質(zhì)粒載體。