PCR檢測常見問題之假陽性分析

 　　PCR檢測常見問題之假陽性分析
　　利用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因成分時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴(yán)重后果。為了提高轉(zhuǎn)基因檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，PCR檢測應(yīng)盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴(kuò)增和涂抹帶現(xiàn)象的發(fā)生。一個好的PCR方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、重現(xiàn)性、魯棒性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴(kuò)增。
　　本文對PCR檢測中出現(xiàn)的假陽性原因進(jìn)行分析
　　（一）假陽性現(xiàn)象
　　假陽性是指檢測陰性材料得到陽性結(jié)果。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測結(jié)果可能有假陽性。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn)。
　　（二）造成假陽性的原因
　　1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；
　　2. PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
　　3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
　　4. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
　　5. 實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室，這個問題比較常見。